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  • 我校科研团队开发单细胞DNA甲基化测序新方法

    来源:www.cecemca.com 发布时间:2020-01-09

    南湖新闻网(记者李翔、李金山)近日,国际知名学术期刊《分子植物》以“BRIF-SEQ :亚硫酸氢盐转化的单细胞水平随机整合片段测序”为题,在线发布了我们玉米研究团队的最新研究成果。该团队开发了一种单细胞脱氧核糖核酸甲基化测序技术,可广泛应用于不同的物种和组织,并独立于脱氧核糖核酸甲基化状态。博士后候选人李翔和博士生陈露是本研究的共同主要作者,严建兵教授和李庆教授是共同交流作者。

    5-甲基胞嘧啶(5MC)是一种常见的脱氧核糖核酸修饰类型,可以调节基因表达、转座子和染色体状态。科学家利用单细胞亚硫酸氢盐测序(SCBS-SEQ)检测出人类生殖细胞、胚胎细胞和神经细胞中大量的脱氧核糖核酸甲基化异质性,这对理解生殖发育和疾病预防具有重要意义。同样,鉴定植物甲基化的细胞异质性也很有价值,但在植物中进行单细胞脱氧核糖核酸甲基化测序却极具挑战性。一方面,细胞壁的存在使得分离单细胞变得困难。另一方面,特别是对于高甲基化和高重复的基因组,亚硫酸氢盐转化的DNA片段也难以用于数据库构建和测序。原因可能是当亚硫酸氢盐用于处理脱氧核糖核酸时,未甲基化的胞嘧啶很可能转化为尿嘧啶,并且去嘧啶化形成非碱基位点的可能性也很高。当用亚硫酸氢盐处理脱氧核糖核酸时,含有大量重复序列的超甲基化基因组可能产生长的非碱基片段。通过scBS-seq方法扩增片段后,最终产生长文库片段。总之,scBS-seq的扩增方法可能不擅长处理高度甲基化和高度重复的基因组。

    为此,李翔博士发明了一种新的扩增方法亚硫酸氢盐转化随机整合片段测序(BRIF-SEQ)。与scBS-seq的扩增策略相比,即第一步扩增的小片段直接加入接头测序,BRIF-seq方法的不同之处在于随机扩增产生的小片段经过单链连接、丙二醛扩增和基于Tn5的数据库构建步骤。这些步骤确保不同长度的转化片段可以进入文库测序。由于BRIF-seq的构建步骤包括单链脱氧核糖核酸片段的连接,测序的阅读片段可能包含两个不同位置的片段。为此,博士生陈露开发了一种快速切割阅读片段的方法,使不同来源的连接片段可以与基因组进行比较,从而达到最大限度利用数据的目的。

    结果证明由短链抗体序列产生的阅读片段比短链抗体序列具有更高的比对率和基因组覆盖率。对于玉米的单个小孢子,7500万个比较阅读片段可以实现最有效的基因组覆盖(35%)。通过不断增加测序数据量,覆盖率可以提高到41.8%。此外,发现scBRIF-seq的阅读片段确实可以比ScBBs-seq覆盖更多的超甲基化片段,因此scBRIF-seq是一种更无偏地覆盖基因组且不依赖于脱氧核糖核酸甲基化水平的方法。因此,理论上,高比率、高覆盖率的BRIF-seq方法可以广泛应用于不同物种、不同组织和不同甲基化水平的细胞。

    通过scBRIF-seq,研究人员发现玉米四分体之间的脱氧核糖核酸甲基化水平存在显著差异,而同一四分体的四个小孢子之间的甲基化水平没有显著差异。还鉴定了细胞间的异质位点。这些结果表明玉米雄配子体发育中存在严重的甲基化重编程和巨大的细胞异质性。玉米作为农作物的模式生物,值得进一步研究。在不同的物种中,也有许多生物现象需要通过识别细胞异质性来分析。现在BRIF-seq为不同物种提供了一种相对无偏的单细胞脱氧核糖核酸甲基化检测方法。

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    点评:赵肖剑

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